一、應用背景
甲基硫菌靈(又名甲基托布津)是一種廣范譜內吸型殺菌劑,被廣泛用于防治果品的輪紋病和黑腐病及貯藏期的青霉病和綠霉病等。但因生產商和銷售環節的違規操作,使果品中甲基硫菌靈的含量超過國家標準(GB14870-94)規定（最高留限量每千克不超過0·5mg）。
為防止高殘留農藥的果品及加工品上市,國家要求銷售前按國標SN0162-92用氣相色譜—質譜儀法,測定甲基硫菌靈的含量。但該方法儀器昂貴,操作技術復雜。為此介紹一種簡便易行、準確可靠、一般實驗室即可測試的紫外分光光度計測定法。
二、應用儀器
紫外分光光度計，電子分析天平，離心機，燒杯，吸管，容量瓶，吸水紙，ph試紙
三、應用試劑及配制
精確稱取50mg甲基硫菌靈可濕性粉劑,放入燒杯中,用三氯甲烷溶解,定容至50ml。從中準確吸取10·00ml甲基硫菌靈的標準液,移入100ml容量瓶中,用三氯甲烷稀釋至刻度,制成甲基硫菌靈標準使用液。同樣精確稱取50mg多菌靈放入50ml容量瓶中,用1mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度。再準確吸取10·00ml多菌靈標準儲備液,移入100ml容器瓶中,用1mol/L鹽酸溶液定容至刻度,制成多菌靈標準使用液。
四、待測樣品的提取和分離
隨機抽取果實樣品,用清水洗去泥沙,晾干或用吸水紙吸干果實表面的水。將果實縱切分成兩等份,取果肉部分,置于干燥的組織搗碎機或研缽內破碎磨細。稱取50g果泥樣品,加50ml甲醇,用高速離心機(每分鐘6000轉)離心分離10分鐘,移上清液于燒杯中。沉淀物用20ml甲醇攪勻后,加水10m,l作用10分鐘,再次高速離心10分鐘。上清液并入盛濾液的燒杯中,在80℃水浴上用熱空氣流吹去部分甲醇,倒入分液漏斗中,加10%的氯化鈉溶液30ml和25ml石油醚,混合搖動2分鐘后,再加25ml石油醚振搖2分鐘以充分提取待測物藥液。除去石油醚,加鹽酸提高酸度至pH值1~2,用二氯甲烷提取兩次(每次加25m,l作用2分鐘)。合并兩次的提取液,用25ml蒸餾水洗滌1次,用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層,移入干燥的分液漏斗中,供甲基硫菌靈含量測定之用。水洗液合并入水層,留作多菌靈測定用。
五、繪制標準曲線
準確吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml甲基硫菌靈標準使用液(相當于0、10、30、50μg甲基硫菌靈),分別置于30ml圓底離心器中,離心揮干溶劑后,各加入10ml乙酸-乙酸銅溶液及2~5粒玻璃珠,接上空氣冷凝器,于酒精燈或微型電爐上緩緩加熱煮沸30分鐘取下,用20ml濃度為1mol/L的鹽酸洗滌冷凝管和圓底離心管,作用2分鐘。將液體移入125ml分液漏斗中。用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層移入備用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氫氧化鈉中和,調整pH值至6·0~6·5(堿液用量為25ml),中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把兩次的提取液合并在一起,再用10ml蒸餾水洗滌分液漏斗,靜置分層后,將二氯甲烷層并入另一存有二氯甲烷層的分液漏斗中。準確加入10ml濃度為1mol/L鹽酸,再次提取5分鐘,靜置10分鐘左右。待分層后,將酸提取液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調節分光光度計的零點,在波長282nm處分別測0~50μg甲基硫菌靈標準液的吸光度(A282)。以A282值為縱坐標,甲基硫菌靈的含量為橫坐標,繪制甲基硫菌靈的標準曲線。準確吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml多菌靈標準使用液(相當于0、10、30、50μg多菌靈),放入分液漏斗各加入20ml濃度為1mol/L的鹽酸,用二氯甲烷提取2次,每次用10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層,移入干燥的分液漏斗中。酸液用2mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸餾水洗滌1次。靜置分層后,將兩次的二氯甲烷層合并,準確加入10ml濃度為1mol/L的鹽酸,再次酸提5分鐘。靜置10分鐘。待分層后,將酸提液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調節分光光度計的零點。在波長282nm處分別測0~50μg多菌靈標準液的吸光度值(A282)。以A282值為縱坐標,多菌靈的含量為橫坐標,繪制多菌靈的標準曲線。
六、測定果品中的甲基硫菌靈和多菌靈含量
取果肉的二氯甲烷提取液,自然揮干或加熱揮干后,用10ml乙酸-乙酸銅溶液分次溶解殘渣,并移入30ml圓底離心器中,加2~5粒玻璃珠,接上空氣冷凝管,用酒精燈或微型電爐緩緩煮沸30分鐘取下,用20ml濃度為1mol/L的鹽酸從冷凝管頂端洗滌冷凝管和圓底離心管,作用2分鐘。將液體移入125ml分液漏斗中,用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層移入備用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氫氧化鈉中和,調整pH值6·0~6·5(堿液用量為25ml)。中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把兩次的提取液合并在一起,再用10ml蒸餾水洗滌分液漏斗,靜置分層后,將二氯甲烷層并入另一種存有二氯甲烷層的分液漏斗中,準確加入10ml濃度為1mol/L的鹽酸,再次提取5分鐘,靜置10分鐘左右。待分層后,將酸提取液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調節分光光度計零點。在波長282nm處測樣品的吸光度。與甲基硫菌靈的標準曲線比較,計算樣品中甲基硫菌靈的含量。取“待測樣品的提取和分離”中的多菌靈測定液,用2mol/L氫氧化銨溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸餾水洗滌1次,靜置分層后,將兩次的二氯甲烷層合并,準確加入10ml濃度為1mol/L鹽酸,再次酸提5分鐘。靜置10分鐘,待分層后,將酸提液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調節分光光度計零點。在波長282nm處測定樣品的吸光度。與多菌靈的標準曲線比較,計算樣品中多菌靈的含量。
測定結果按下式計算:X=V1×Cm×V2×100，式中V1為加入提取溶劑的總毫升數;m為樣品重量(g);V2為測定時使用提取溶劑的毫升數;C為相當于標準濃度(mg);X為樣品中甲基硫菌靈的含量(mg/kg)。
(注意:用石油醚和二氯甲烷萃取的整個過程,不論加入量還是取出量,必須準確、快速。當甲基硫菌靈殘留量過高時,可減少樣品的用量或增加稀釋倍數。)
