方案概述
1、菌種：污水中的大腸菌群
2、培養(yǎng)基：乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂EMB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
3、儀器及器材：電爐、雙目顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫干燥箱
4根接種環(huán)、干燥器、冰箱、4個(gè)250ml錐形瓶、3支產(chǎn)氣管、17支試管、6套培養(yǎng)皿、14支無菌移液管（12支1ml管、2支10ml管）
注：
1.乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液態(tài)、鑒別、增值、半合成培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)中用于廢水中菌群的培養(yǎng)；
2.伊紅美藍(lán)瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍(lán)和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，特別是大腸菌群和糞大腸菌群；
3.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化后的菌體培養(yǎng)。
一、實(shí)驗(yàn)整體安排
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；
采樣、恒溫培養(yǎng)富集及初篩；
觀察產(chǎn)氣情況及稀釋、倒培養(yǎng)基、劃線、涂布、倒置培養(yǎng)；
鑒定、接種；
菌種保藏。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備具體操作步驟
①配置培養(yǎng)基(伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基：7.4g+200mL無菌水、調(diào)pH7.2～7.4，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：6.6g+200mL無菌水、調(diào)pH7.4±0.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基2.6g+100mL無菌水，調(diào)pH7.4±0.2),，裝瓶，高壓蒸汽滅菌。
②包扎好培養(yǎng)皿，移液管，試管，進(jìn)行干熱滅菌。
③將配好的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基分裝入三個(gè)試管中，每個(gè)大約十毫升，包扎，滅菌。
④液體石蠟和涂布棒等其他實(shí)驗(yàn)玻璃器進(jìn)行滅菌。
三、采樣、培養(yǎng)
取水，湖水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基試管中，貼好標(biāo)簽（采樣時(shí)間、人物、溫度，采樣地點(diǎn)及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養(yǎng)18～24小時(shí)；
觀察產(chǎn)氣情況、稀釋
①觀察產(chǎn)氣管有無氣柱，標(biāo)記陽(yáng)性管數(shù)。
②樣品稀釋：
對(duì)已滅菌的5只試管編號(hào)（分別為1、2、3、4、5號(hào)），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號(hào)試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標(biāo)簽。
采用劃線、涂布法，具體如下：
①涂布平板法：
將已熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。
涂布平板法操作：
1.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中；
2.取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面；
3.將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s；
4.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。
注意：
1.將涂布器末端浸在盛有體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精的燒杯中。取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2.操作中一定要注意防火，不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）
②平板劃線法：
經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，接種環(huán)以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散。在37℃經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后，可在平板表面得到單菌落。（有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。）
平板劃線操作：
四、鑒定
觀察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。
五、菌種保藏
1、斜面低溫保藏法
此法為最常用的一種。一般霉菌；放線菌和有芽孢的細(xì)菌可保存2～4個(gè)月，酵母菌可保存2個(gè)月，無芽孢的細(xì)菌最好每周移接一次。操作過程如下：
a.接種：將要保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基上，試管上貼好標(biāo)簽，寫上菌種名稱，時(shí)間。
b.培養(yǎng)：各類菌按其所需溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。
c.保藏：選取生長(zhǎng)健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4℃冰箱中保藏。
2、液體石臘保藏法
此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時(shí)間是半年至一年。放線菌；霉菌和產(chǎn)芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，而引起的菌種死亡。同時(shí)可阻止氧氣進(jìn)入，防止好氧菌的生長(zhǎng)。從而延長(zhǎng)菌種保藏的時(shí)間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過程如下：
a.液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌二次（120℃30分鐘）。再在110～120℃干燥箱中蒸發(fā)掉蒸汽滅菌時(shí)帶入的水分。此時(shí)石臘透明清亮狀。經(jīng)檢驗(yàn)確定無菌后備用。
b.菌種培養(yǎng)：將所需的菌種經(jīng)培養(yǎng)后，選取健狀的保藏。
c.加石臘油：用無菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點(diǎn)1cm為宜。少了會(huì)因培養(yǎng)基露出油面，而使培養(yǎng)基變干造成菌死亡。
d.收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。
e.恢復(fù)使用：當(dāng)要使用菌種時(shí)。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復(fù)使用。接種培養(yǎng)。由于菌體外粘有油。第一次的菌生長(zhǎng)緩慢，性狀恢復(fù)不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌種。
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