液相色譜儀的進樣量能有多大？這個問題是不嚴謹?shù)摹Ｒ驗閱栠@樣的問題就相當于問“人的飯量有多大”一樣沒有答案。
對于液相色譜來說，進樣量除了跟色譜柱的尺寸、柱效、目標物與色譜柱的匹配度、梯度初始比例有關，也跟樣品有關：以反相色譜為例， 100%有機相（強溶劑=干米），50%有機相（弱溶劑=水，50%有機相=飯）和10%有機相（稀飯）的進樣量是不一樣的。
相同色譜柱，進樣溶劑不同，允許進樣量不同的根本原因是溶劑效應：溶劑效應本質(zhì)是大體積的強溶劑攜帶著目標物進到色譜柱后將取代流動相形成一個獨立的液段，這一液段對目標物有很強的攜帶能力，且強溶劑液段在色譜柱中幾乎沒有保留，最終目標物被強溶劑拖帶拉寬，形成很長的前延峰，甚至有一部分目標物被強溶劑脫裂跟隨其一起在死時間出峰。
如果有一個方法，可以把強溶劑快速稀釋成弱溶劑，是不是可以提高進樣量？島津設計了一種新的在線稀釋技術，其原理如圖1，配置如圖2：
在線稀釋技術將強溶劑與高比例的弱溶劑通過高效混合器瞬間稀釋成一個90-95%的弱溶劑，再注入到色譜柱，因為弱溶劑無法推動目標物往前移動，此時目標物將在柱頭聚焦，待目標物全部聚焦在柱頭，再提高強溶劑比例，使分析物分離得到尖銳對稱的色譜峰。
那這個在線稀釋技術有什么用？
1、大體積水的直接進樣
在線稀釋技術最初被應用在大體積水樣的直接進樣分析中：大部分的普通液相色譜柱是不允許100%水樣直接進樣的，因為其硅膠基質(zhì)容易被水解離形成不可逆損壞。使用在線稀釋技術可以在大體積水進樣的同時加入小比例的有機相（5%或10%），使其在線形成液相色譜可接受的進樣溶劑。圖2為1mL水直接進樣分析十種抗生素得到的色譜圖，全程自動化運行，靈敏度高、精密度好。
2、大體積有機相的直接進樣
大部分的樣品前處理都包括強溶劑的萃取或強溶劑的洗脫定容為終結——因為強溶劑對目標物的溶解度高。然而大體積的強溶劑直接進樣很容易噎死色譜柱。用我們的在線稀釋技術可以完美解決：利用在線稀釋大體積分析系統(tǒng)直接進樣分析200μL乙腈白菜提取液中24種農(nóng)殘，得到色譜峰尖銳對稱，方法精密度優(yōu)異，靈敏度大大提高。圖4為本系統(tǒng)與普通超高效液相色譜系統(tǒng)的譜圖對比，可見左圖200μL進樣溶劑在普通超高效液相色譜系統(tǒng)有非常嚴重的溶劑效應，而在右圖在線稀釋大體積系統(tǒng)中峰型尖銳對稱，靈敏度大大提高。
3、雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS
大體積進樣量有可能會帶來一個問題，即基質(zhì)雜質(zhì)增加，影響定量準確度。固相萃取SPE是一種有效的樣品富集和除雜手段，廣泛應用于食品、環(huán)境或生物樣品的前處理。但手工操作的離線SPE存在操作繁瑣復雜、耗時、重現(xiàn)性差等缺點，而在線SPE-HPLC可以部分解決以上問題。
目前的在線SPE-HPLC系統(tǒng)一般分為兩步進行，第一步是富集+除雜質(zhì)，第二步是解吸+分離。見圖5所示。該系統(tǒng)通常由兩個流路連接一個六通閥組成，萃取柱連接在六通閥上。第一個流路（虛線部分）是提取和富集，另一個流路（實線部分）是樣品的解吸和高效液相色譜分離。分析開始時，樣品由自動進樣器導入，隨后被液相泵推動通過SPE柱完成目標物的富集（弱保留雜質(zhì)流經(jīng)SPE柱而無保留）。然后切換閥門，SPE柱被切換到兩個色譜泵和色譜柱之間，流動相A和B兼任解吸液，將目標物從SPE柱上解析下來并隨后進入色譜柱進行分離分析。
然而，這個系統(tǒng)有幾個缺點：首先解吸分離步驟中，SPE柱連在兩個泵和色譜柱之間，這意味著只能耐受常壓的SPE柱要承受和高效液相色譜柱相同的壓力；其次，如果使用與這個SPE柱相匹配的常規(guī)色譜柱，通常直徑為4.6mm，最優(yōu)流量為1mL/min，超出了ESI源離子化承載的流量，因此需要通過降低流速或柱后分流等手段減少ESI負荷，最終導致方法靈敏度下降；第三，流動相A和B兼任解吸液和分離溶液，在大多數(shù)情況下，最佳解吸溶液與最佳流動相不是同種溶液，最終導致解吸效率下降或峰展寬；最后，樣品為生物樣品或高比例強溶劑萃取液時，在進樣前需要用弱溶劑離線稀釋，雖然離線稀釋即耗時又間接減小了進樣濃度，但非常有必要：一是將目標化合物與基質(zhì)脫附（如藥物與蛋白質(zhì)的脫附）；二，將高比例強溶劑稀釋為高比例弱溶劑，以提高過柱過程中在萃取柱上的保留。
為解決以上缺點，島津設計了雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統(tǒng)，其配置和流路設計見圖6。
這個系統(tǒng)有三個分析步驟：
（1）第一步是樣品的稀釋和提取。樣品通過自動進樣器直接注入系統(tǒng)，通過泵D稀釋溶劑推送進入高效混合器1，樣品被在線稀釋為弱溶劑。然后稀釋液加載到固相萃取柱完成目標物的富集及雜質(zhì)的去除。
（2）當富集除雜完成后，切換閥1，進行目標物的解吸和捕獲。在這一步中，泵C推送最優(yōu)的解吸液到固相萃取柱，目標物被解吸液解吸并移動經(jīng)過500μL定量環(huán)，調(diào)整分析方法至絕大部分目標物捕集到定量環(huán)1中，切換定量閥進入第三步。
（3）第三步是解吸液的柱前稀釋，以及進行超高壓的樣品分離分析。柱前稀釋的原理即為此前提到在線稀釋，可即時將解吸液稀釋為90%以上的弱溶劑，然后才進入超高壓液相色譜柱。此時弱溶劑完全沒有洗脫能力，因此目標物將在色譜柱頭進行聚焦。之后改變有機相比例，實現(xiàn)梯度洗脫，得到尖銳的色譜峰形。在此過程中實現(xiàn)了解吸液的柱前稀釋、超高壓的色譜分離。此時超高壓色譜柱使用的是最優(yōu)流速，且無需分流，與質(zhì)譜完美匹配，提高分析的靈敏度。
該在線系統(tǒng)相對于普通SPE-HPLC系統(tǒng)有以下優(yōu)點：
（1）實現(xiàn)萃取前樣品的在線稀釋，免除離線稀釋的手工誤差；
（2）破除分離色譜柱的局限性，可以使用UHPLC高壓柱，分離條件與SPE萃取條件相互獨立，與ESI質(zhì)譜相匹配；
（3）獨立解吸泵推送解吸液：可以使用最優(yōu)解吸條件，并具有解吸效率最高，解吸時間最短，解析液體積最小等優(yōu)點；
（4）解吸溶劑的截獲&切換：在解吸條件最優(yōu)的條件下，使用500 μL定量環(huán)（可隨SPE尺寸調(diào)整），確保解析液全部被截獲；定量環(huán)還起到壓力過度作用，SPE柱不與UHPCL柱串聯(lián)，全程處于低壓狀態(tài)；
（5）大體積解吸溶液的在線稀釋，實現(xiàn)柱頭聚焦和有效UHPLC分離。
我們用這個系統(tǒng)先后應用于植物提取液中三種植物激素和血漿樣品中十種抗精神病藥的直接檢測，得到了滿意的結果：
（1）雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統(tǒng)用于植物提取液中植物激素的直接檢測
（2）雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統(tǒng)用于血漿中十種抗精神病藥的直接檢測
由以上應用實例我們可以看到，使用島津獨有的在線稀釋技術，可以大大提高超液相色譜的飯量，不但能提高靈敏度，而且能夠應用在在線分析系統(tǒng)，實現(xiàn)目標物的富集和雜質(zhì)去除，得到滿意的分析結果。
