液相色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)，封尾技術(shù)和裝柱技術(shù)等。
一、色譜填料技術(shù)
填料的差異對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響，色譜填料的鍵合相密度的不同也會影響到填料表面硅羥基裸露的多少，進而影響填料的選擇性。
1、填料分類及方法
填料分為濕法填充和干法填充，資料顯示在正常條件下，填料粒度＞20μm時，干法填充制備柱較為合適，顆粒＜20μm時，濕法填充較為理想。
填充方法一般有4種：
①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；
②徑向加壓法；
③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱，如DAC；
④干法柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。
2、色譜柱填料粒徑
在色譜分析工作中，該怎么選擇色譜柱的中填料的粒徑呢？目前市場上主要可供選擇的分析用填料粒徑主要有以下幾種：
①1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀
②3.0μm、3.5μm-----快速液相色譜柱：普通快速分析
③5μm-----常規(guī)分析
其中5μm的粒徑是最常用的，但是這里是指平均粒徑是5μm，也有可能有3μm和5μm粒徑的填料。當然色譜填料的粒徑越小，理論塔板高度越低，相應(yīng)的柱效越高，分離度和靈敏度就越好，而且在高線速度區(qū)域，柱效的降低也得于緩和，但是壓力會成倍上升。通常我們會結(jié)合色譜柱的長度來綜合選擇色譜柱的粒徑，長度和粒徑都是用來改變柱效的，選擇原則是夠用就好。當待分離物質(zhì)≤5個時，150mm柱長的色譜柱可以滿足大多數(shù)樣品的分離。
3、色譜填料的孔徑和比表面積
現(xiàn)在多孔填料的 95%以上表面積在孔內(nèi)部，這樣只有分析目標物進入孔內(nèi)，才能達到分析分離的目的。而只有樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進入微粒內(nèi)部。對于小分子的反相分離，選擇小孔徑（60Å ~120Å）填料柱，對于小分子和多肽使用100Å~150Å，而只有當目標物的分子量大于2000 時我們才會選擇300Å孔徑的填料。如藥典上介紹測定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為300Å，因為在做多肽類樣品的時候，300Å孔徑的填料相對100Å孔徑肯定要選擇性好點，也就是分離度相對比較好點。因為蛋白分子量＞2000，會對進入120Å填料的孔造成困難，從而進不了孔，沒有保留，就在填料表面，隨著溶劑一同出峰。我們一般選擇填料的時候，要求孔徑至少是分子直徑的三倍，從而保證分子可以進入到孔內(nèi)。
每克填料的比表面積與孔徑和粒徑有關(guān)，隨著孔徑的增加，比表面積降低。目前比表面積一般為：180m2/g-350m2/g，隨著比表面積增大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加（梯度洗脫尤為注意）。我們在日常色譜分析工作中可根據(jù)需要選擇合適的比表面積。
二、色譜封尾技術(shù)
什么是色譜柱的封尾？由于空間位阻的存在，鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋 50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團會發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三J基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，或稱為封端、封口。
封尾與不封尾的色譜填料有什么區(qū)別呢？封尾消弱硅羥基作用，不封尾提高硅羥基影響，增強極性物質(zhì)的保留，降低柱流失，但是有些物質(zhì)會在不封尾的柱子上產(chǎn)生拖尾。
封尾技術(shù)中用到的封尾試劑的差異也會對色譜柱的性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響，如體現(xiàn)在色譜填料的pH耐受范圍，水相耐受范圍，極性強弱等。
三、色譜裝柱技術(shù)
裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，需要經(jīng)驗積累。
