分光光度的概述
吸光光度法定義:
基于物質對光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法，包括紫外可見分光光度法及紅外光譜法等。
紫外可見分光光度法所用的光譜區域為200~780nm，其中紫外分光光度法為200~400nm，可見分光光度法為400~ 780nm。
紅外光譜法為2.5~1000um。
分光光度法的發展歷程:
最初人們發現很多物質都具有顏色，例如Mn04-為紫紅色，Fe3+為黃色，當含有這些物質的溶液濃度改變時，溶液顏色的深淺度也就隨著改變。溶液越濃顏色越深，溶液越稀顏色越淺，因此利用比較溶液顏色深淺的方法來確定溶液中有色物質的含量，這種方法稱為“目視比色法”，隨后人們又認識到溶液的顏色是由于對光的選擇性吸收而產生的，可以利用濾光片和光電池客觀的測量溶液的濃度，從而出現了“光電比色法”。隨著近代測試儀器的發展，用分光光度計代替比色計，出現了分光光度法。
分光光度法基本原理
溶液顏色與光吸收的關系日常所見的白光，如日光、白熾燈光，都是混合光，即它們是由波長400~780nm的電磁波按適當強度比例混合而成的，這段波長范圍的光是人們視覺可覺察到的，所以稱為可見光。當電磁波的波長小于400nm時稱為紫外光，大于780nm的稱為紅外光，都是人們視覺覺察不到的光�；パa色光:當將某兩種顏色的光按適當強度比例混合時，可以形成白光，這兩種色光就稱為互補色光。
當一束白光(混合光)通過某溶液時，如果該溶液對可見光區各種波長的光都沒有吸收，即入射光全部通過溶液，則溶液呈無色透明狀。當該溶液對可見光區各種波長的光全部吸收時，則該溶液呈黑色。
如某溶液對可見光區某種波長的光選擇性地吸收，則該溶液即呈現出被吸收波長光的互補色光的顏色。
例如當一束白光通過KMnO4溶液時，該溶液選擇性的吸收了綠色波長的光，而將其它的色光兩兩互補成白光而通過去，只剩下紫色光未被互補，所以KMnO4溶液呈現紫色。
光吸收曲線
光吸收曲線:將不同波長的光依次通過某一定濃度和一定厚度的溶液，分別測出它對各種波長光的吸光度，以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制成的曲線(亦稱吸收光譜)最大吸收波長(Aμaξ) :在吸收曲線上吸收峰最大處所對應的波長。
標準曲線的繪制
配制一系列不同濃度的標準溶液，在一定條件下顯色，使用同樣厚度的吸收池，測定吸光度，上然后以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得一條直線，在同樣條件下測出試樣溶液的吸光度就可以從工作曲線上查出試樣溶液的濃度。但在實際工作中經常發現標準曲線不成直線的情況，特別是當吸光物質的濃度高時，明顯的向上或向下偏離標準曲線，這種情況稱為偏離朗伯-比耳定律現象。
引起偏離朗伯-比爾定律的原因
(1)入射光為非單色光。嚴格講朗伯-比耳定律只適用于單色光。應選用Aμaξ處或肩峰處測定。
(2)溶液中的化學反應。離解、絡合、締合會破壞線性關系，應控制條件(酸度、濃度、介質等)。
(3)比耳定律的局限性引起偏離。嚴格說，比耳定律是一個有限定律，它只適用于濃度小于0.01mol/L的稀溶液。
